استفاده صحیح از ستون HPLC در طول عمر آن نقش زیادی دارد، دراین مقاله به شما برخی از نکات و دستورالعمل­های استفاده، تمیز کردن، نگهداری و بازسازی ستون HPLC را آموزش خواهیم داد.

   ستون­های مبتنی بر پایه سیلیکا(Silica)

دستورالعمل عمومی نگهداری و بازسازی ستون HPLC :

     سیلیکا یک تکیه گاه (Support) مناسب برای ستون­های HPLC محسوب می­شود. پایداری مکانیکی بالا، خواص فیزیکوشیمیایی سطح عالی، طیف وسیع اتصالات(Bond) و سازگاری با انواع حلال­های آلی از نقاط قوت آن به شمار می­رود. نکات ذیل در استفاده از ستون­های Silica اهمیت فراوان دارد.

• پایداری pH

      به طور کلی ستون­های HPLC در محدوده pH بین 2 الی 8 پایدارند. اندازه گیری pH باید قبل از مخلوط کردن ماده شوینده(Eluent) با حلال­های آلی انجام شود. ستون­های پیشرفته تر HPLC را می­توان حتی خارج از محدوده مذکور نیز استفاده کرد. پیوند­های شیمیایی جدید در برخی موارد امکان استفاده از ستون را حتی در pH زیر 1 نیز فراهم می­کند. با این حال قبل از استفاده از ستون Silica خارج از محدوده pH مجاز، حتما دستورالعمل کمپانی سازنده را مطالعه کنید. بیشترین طول عمر ستون، با رعایت محدوده pH بین 2 تا 6/8 حاصل می­گردد.

    فازهای ساکن مبتنی بر سیلیکا ژل فوق العاده خالص را  بسته به ماهیت شیمیایی اصلاح کننده­های(Modifier) استفاده شده در ساختار فاز سیال می­تواند حتی تا pH حدود 11 هم مورد استفاده قرار گیرد.

     مبادی بزرگ(Larg base) مانند پیرولیدین، توانایی حمله به سطح سیلیکا را ندارند، لذا می­توان در pH بالاتر مورد استفاده قرار گیرند. درصورتی که در pH حدود 8 و در مبادی کوچک به عنوان اصلاح کننده(مانند آمونیاک) کار می­کنید پیشنهاد می­شود که از فاز ساکن بر پایه پلیمرها و یا زیرکونیا دی اکساید استفاده کنید.

• پایداری مکانیکی

     فازهای ساکن بر پایه سیلیس از نظر مکانیکی بسیار پایدار هستند و هیچ محدودیت فشاری از خود نشان نمی­دهند به گونه ای که می­توان بدون هیچ مشکلی در فشارهای بالای 40 Mpa(6,000 Psi) از آنها استفاده کرد. با این حال باید از هرگونه شوک فشاری در ستون اجتناب شود، به نحوی که فشار سیستم به ناگهان افزایش پیدا نکند. شوک فشاری باعث ایجاد کانال­هایی در داخل ستون خواهد شد که نتیجه آن شکافت(دو یا چند شاخگی) در نوک پیک کروماتوگرام خواهد بود.

• فاز متحرک یا شوینده(Eluent)

     فاز­های ساکن بر پایه سیلیکا با تمام حلال­های آلی در pH های ذکر شده سازگاری دارد. اما باید از محلول­هایی با بهترین کیفیت و خلوص(HPLC grade) استفاده شود و نیز قبل از استفاده در سیستم از فیلتر 0.5 µm عبور داده شود. همیشه در نظر داشته باشید قوی ترین فیلتر ستون شماست!!

     استفاده از حلال­های ناخالص باعث جذب برگشت ناپذیر ناخالصی­ها در سر ستون و انسداد مسیرهای جذب در طول ستون خواهد شد که می­تواند دلیل تغییر ماهیت ستون در بازدارندگی شود. تغیر در بازدارندگی نیز دلیل شکافتگی(Splitting) در نوک پیک کرماتوگرام خواهد بود. این ناخالصی­ها دلیل اصلی پیدایش پیک غیر واقعی(Ghost peak) در شستشوی گرادیان (gradient elution) نیز هستند. این نوع پیک همیشه در یک نقطه از کروماتوگرام ظاهر می­شوند و دلیل وجود انها آنالیت نیست بلکه ناخالصی­های حاصل از حلال و یا افزودنی­های دیگر با عث شکل گیری آنها شده اند. بنابراین در شستشوی گرادیان توصیه می­شود قبل از هرگونه تزریق ابتدا پیک­های غیر واقعی را مشخص کنید. برای جلوگیری از هرگونه جذب برگشت ناپذیر ناخالصی در ابتدای ستون باید همیشه از پیش ستون متناسب با ستون اصلی استفاده کنید. استفاده از پیش ستون باعث افزایش چشمگیر عمر ستون خواهد شد. برای اطمینان بیشتر میتوان از فیلترهای مسیر(in-line filter) نیز استفاده کرد. این فیلترها مستقیما به ستون متصل شده و انواع ذرات جامد شوینده را جذب می­کنند اما قادر به جذب ناخالصی­های آلی نیستند!

• نگهداری ستون بلا استفاده

• برای کوتاه مدت مثلا یک شب، می­توان ستون را با آخرین شوینده استفاده شده شستشو و نگهداری کرد.
• برای زمان متوسط مثلا دو روز آخر هفته، ستون باید حتما با آب خالص جهت ممانعت از رشت میکروارگانیسم شستشو داده شود.
• برای نگهداری طولانی ستون­های مبتنی بر پایه سیلیکا باید در حلال آپروتیک(Oprotic solvent) نگهداری شوند. مقدار آب نیز نباید بیش از 50 درصد باشد. بهترین حلال آپروتیک استونیتریل است.

احتیاط !!!

        قبل از شستشو با استونیتریل از شسته شدن کامل بافرها اطمینان حاصل شود زیرا نمک­های بافر معمولا در استونیتریل محلول نیستند و می_­توانند باعث انسداد ستون و لوله ­های مویین سیستم شوند.

• زمان تعادل ستون

       زمان تعادل یک ستون به ابعاد آن بستگی دارد و بطور کلی یک ستون بعد از شستشو با حجمی برابر با 20 برابر حجم خود با شوینده به تعادل می­رسد.زمان تعادل برای برخی از ستون­های پر کاربرد به شرح جدول زیر خواهد بود:

نگهداری و بازسازی ستون HPLC

        در صورت افزایش سرعت جریان شوینده می­توان به زمان تعادل کوتاهتر دست یافت اما با این حال 100 درصد تعادل زمانی اتفاق خواهد افتاد که ستون با 20 برابر حجم خود شستشو شده باشد.

• نگهداری بازسازی ستون(Regeneration)

        نگهداری و بازسازی ستون HPLC ناخالصی­های برگشت ناپذیر حاصل از ماتریـکس باعث ایجاد شکانفتگی در نوک پیک کروماتوگرام می­شود و اما در برخی موارد می­توان از طریق پروتوکول­های ذیل نسبت به بازسازی ستون­های آلوده تا حدی اقدام کرد:

بازسازی ستون­های فاز معکوس(RP)

ستون­های فاز معلوس شامل فاز ساکن C18,C8, C4, C1, C30, CN و Phenyl هستند

• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط آب.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط استونیتریل.
• سشتشو با 5 برابر حجم ستون توسط ایزوپروپانول.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط هپتان.
• شستشو با 5 برابر حجم ستون توسط ایزوپروپانول.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط استونیتریل.

• بازسازی ستون­های فازنرمال(NP)

ستون­های NP شامل فاز ساکن سیلیکا، دیول، نیترو و آمینو هستند.

• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط هپتان.
• شستشو با 5 برابر حجم ستون توسط ایزوپروپانول.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط استونیتریل.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط آب.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط استونیتریل.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط ایزوپروپانول.
• شستشو با 20 برابر حجم ستون توسط هپتان.

• بازسازی ستون­های تبادل یونی(Ion Exchange)

ستون­های تبادل یونی مبدل­های آنیونی و کاتیونی هستند(WCX, SCX, WAX and SAX).

• شستشو با 20 باربر حجم ستون توسط شوینده قبل به همراه بافر با غلظت 2 برابر .
• تکرار مراحل شستشوی ستون­های RP(به سطرهای بالا مراجعه کنید).
• شستشو با 20 باربر حجم ستون توسط آب.
• ستون را در حالت اولیه به تعادل برسانید.

ستون­های بر پایه پلیمر

   ستون­های بر پایه پلیمر سازگاری بیشتری در برابر pH از خود نشان می­دهند اما پایداری مکانیکی کمتری در مقایسه با ستون­های پایه سیلیکونی دارند. همچنین این ستون­ها با همه حلال­های آلی سازگار نیستند و در برخی از حلال­های آلی متورم و در برخی دیگر منقبض می­شوند. متاسفانه پایداری فشاری و سازگاری با حلال با توجه به ماهیت پلیمر و کارخانه تولیدکننده متفاوت است. از این رو قانون عمومی برای نگهداری ستون­های مبتنی بر پلیمر وجود ندارد و تنها باید به دستورالعمل و بروشور پیشنهادی کمپانی سازنده مراجعه کرد.

در صورتی که در خصوص بازسازی و نگهداری ستون HPLC سوالی داشتید لطفا با شماره 021 44020118 تماس بگیرید. همکاران ما شما را راهنمایی خواهند کرد.

نویسنده: علی اکبر سلیمانی

شرکت فاطرشیمی نگارفناور

Refrences:

General column care Bischoff [1]

 Waters selection guide[2]

[3] Agilent column selection

فایل PDF مراقبت عمومی از ستون HPLC